В иммуноблот на вич белок 41 сомнительный. Иммуноблот – что это такое? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний. Диагностика ВИЧ у новорожденных

ИММУНОБЛОТ (western blot) - метод лабораторного исследования сыворотки крови на присутствие антител к ВИЧ; это более точный анализ, чем ИФА, и используется для подтверждения результатов ИФА. ИФА - иммуноферментный анализ (ELISA) -лабораторное исследование, позволяющее определить присутствие в крови ВИЧ-антител; тест на ВИЧ-антитела.

По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА . Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120 , gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.

Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и "промокают" (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из гела на мембрану. В результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала, добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса антиген - антитело - меченый коньюгат определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления все становится ясным, есть антигены в крови или их нет.

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Полоска А - Положительный контроль

Полоска В - Слабоположительный контроль

Полоска С - Отрицательный контроль

Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Описание

Метод определения Иммуноблот.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антинуклерные антитела представляют семейство аутоантител, связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, а также часто отмечаются при аутоиммунных заболеваниях печени и ряде других состояний. На сегодняшний день охарактеризованы около 200 разновидностей этого семейства аутоантител, но не все они могут быть использованы в клинической практике.

Иммуноблот антинуклеарных антител позволяет в одном тесте одновременно провести исследование 15 основных разновидностей антинуклеарных антител, что обеспечивает проведение дифференциальной диагностики основных системных ревматических заболеваний. Каждая разновидность аутоантител, выявляемая с помощью иммуноблота, обычно отмечается у пациентов с характерной клинической картиной, поэтому спектр аутоантител позволяет не только диагностировать заболевание, но и установить риск развития определенных клинических проявлений.

Иммуноблот антинуклеарных антител целесообразно использовать на втором этапе серологического обследования при положительном результате других тестов, указывающих на присутствие в сыворотке обследуемого антинуклеарных антител. К таким тестам относятся определение антиядерных антител (скрининг ИФА ), выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на клетках Hep2 (), антинуклеарных антител и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА, ).

Метод иммуноблота антинуклеарных антител в диагностике системных ревматических заболеваний характеризуется высокой клинической специфичностью. Но специфику антинуклеарных антител даже при высоких титрах АНФ () удается установить не всегда, поскольку до сих пор остаются неохарактеризоваными ряд антигенов антинуклеарных антител. Отрицательный результат иммуноблота в этом случае не исключает диагноза системных ревматических заболеваний. Ряд антинуклеарных антител можно выявить с помощью иммуноблота - панель миозит-специфичных аутоантител () и иммуноблота - панель аутоантител при склеродермии ().

Литература

Лапин С.В. Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний/ Издательство «Человек», СПб - 2010. 272 c.
Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. Клинические рекомендации / БХМ, М - 2006.
Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011. 300 p.
Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007. 300 p.
Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008. 598 p.
Инструкции к набору реагентов.

Подготовка

Предпочтительно выдержать 4 часа после последнего приема пищи, обязательных требований нет.

Показания к назначению

Тест показан для диагностики и дифференциальной диагностики следующих состояний:

системная красная волчанка;
подострая кожная волчанка и другие разновидности кожной волчанки;
смешанное заболевание соединительной ткани;
синдром Шегрена и ассоциированные заболевания;
диффузная и локализованная склеродермия, CREST-синдром;
воспалительные миопатии (полимиозит и дерматомиозит);
ювенильный хронический артрит;
аутоиммунный гепатит;
первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит;
использование данного теста показано при обнаружении высоких титров антинуклеарного фактора, антинуклеарных антител, антител к экстрагируемому ядерному антигену, антител к ДНК, антител к нуклеосомам и антифосфолипидных антител.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: качественный тест, результат представляют в форме «обнаружено» или «не обнаружено».

При обнаружении полосы, характеризующей наличие какого-либо вида антител, интенсивность окраски полосы дополнительно описывают количеством плюсов («крестов») для каждого из выявленных видов антител. Увеличение степени позитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.

Референсные значения: антитела к Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1 не обнаружены.

Результат определения аутоантител представляется в «крестах» для каждого соответствующего антигена. Увеличение степени серопозитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител. Варианты результата оценки серопозитивности приведены ниже:

Антитела не обнаружены.
+/- - пограничный результат;
+ – низкое содержание аутоантител к специфическому антигену;
++ – среднее содержание аутоантител к специфическому антигену;
+++ – высокое содержание аутоантител к специфическому антигену.

Основные заболевания, связанные с выявлением антинуклеарных антител:

Антиген	Значение
Sm (Smith)	Специфический маркер системной красной волчанки (входит в 10-ый критерий СКВ Американского колледжа ревматологов, АСR)
SS-A (Ro52)	Отмечается при различных аутоиммунных заболеваниях, чаще при системной красной волчанке и ее кожных формах, системных ревматических заболеваниях, ревматоидном артрите, аутоиммунных заболеваниях печени и т.д.
SS-A (Ro60)	Системная красная волчанка, кожные формы красной волчанки, фоточувствительность при системной красной волчанке, высокий риск врожденной красной волчанки и поражения сердца плода. Основной серологический показатель при синдроме Шегрена. Нередко отмечается совместно с антителами к SS-A (Ro52) антигену.
SS-B	Синдром Шегрена, системная красная волчанка.
PCNA	Системная красная волчанка, риск волчаночного нефрита.
Рибосомы (Ribo P)	Системная красная волчанка, риск поражения центральной нервной системы.
Нуклеосомы	Системная красная волчанка, высокий риск волчаночного гломерулонефрита.
Двуспиральная ДНК	Специфический маркер системной красной волчанки (входит в 10-ый критерий СКВ ACR), высокий риск волчаночного нефрита.
snRNP/Sm	Смешанное заболевание соединительной ткани, системная красная волчанка с низким риском поражения почек, склеродермия.
Гистоны	Системная красная волчанка, лекарственная волчанка, склеродермия.
Scl-70	Системный склероз с диффузным поражением кожи и внутренних органов.
PM-Scl	Cклеродермия, сопровождающаяся полимиозитом.
CENР-B	CREST-синдром со склеродактилией, телангиэктазиями, подкожными кальцинатами, синдромом Рейно, эзофагитом.
Jo-1	Полимиозит в виде антисинтетазного синдрома.
AMA-M2	Первичный билиарный цирроз, синдром Шегрена.

Когда сдал анализы на зппп решил сдать и на вич. На следующии день получил готовые анализы на ифа кроме вич в итоге у меня обнаружили хламидиоз. Герпес и микраплазмоз. Но вич так и не пришел. Звонят мне через 3 дня и говорят вам надо явиться в спид центр перездать кровь я здал на имунаблот имунаблот показал положительным. Может ли имунаблот быть ложноположительным при заболеваниях хламидии микраплазмоз впч герпес

Эксперты Woman.ru

Узнай мнение эксперта по твоей теме

Анастасия Шестерикова

Русина Ирина Владимировна

Психолог, Избавление от стрессов. Специалист с сайта b17.ru

Ольга Юрьевна Диганаева

Психолог. Специалист с сайта b17.ru

Ольга Борисенко

Психолог, Гештальт-терапевт. Специалист с сайта b17.ru

Дмитрий Валериевич Тишаков

Психолог, Супервизор, Системный семейный терапевт. Специалист с сайта b17.ru

Шиян Ольга Васильевна

Психолог, Психолог-консультант. Специалист с сайта b17.ru

Оксана Лушанкина

Психолог, Отношения в семье. Специалист с сайта b17.ru

Анна Дашевская

Психолог, Консультации в Skype. Специалист с сайта b17.ru

Ирина Букина

Психолог. Специалист с сайта b17.ru

Аксёнова Анна Михайловна

Психолог, Кандидат в группаналитики. Специалист с сайта b17.ru

не хоч вас пугать но когда вызывают в спид центр почти всегда положительный как не пересдавай, удачи вам, главное принимать терапию и жить долго

Один знакомый живет с ВИЧ уже десять лет, бережет себя.
Говорят, что года через три возможно найдут лекарство.
В любом случае не отчаивайтесь и не распространяйте это, лечитесь

Нет, ИБ не может быть ложноположительный и никакие зппп не влияют на этот анализ, если он положительный, то увы, у вас ВИЧ, надо следить за иммунными клетками и вовремя начинать терапию.

увы нет ((если вызвали в центр,то точно уже вич

Насколько мне известно, первый и даже последующие результаты иммуноблот могут быть сомнительными. не ложноположительными, а именно сомнительными. и тогда назначают повторный анализ. привожу текст с сайта:
«Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120 , gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.»
можете загуглить. если это так, я надеюсь, что у Вас не подтвердиться ВИЧ. но если и подтвердиться, знайте, что сегодня с этим диагнозом живут и живут столько же, сколько и здоровые люди и детей рожают. главное условие — дисциплина в лечении. здоровья Вам!

Антиретровирусная терапия online

Калькуляторы

Сайт предназначен для медицинских и фармацевтических работников 18+

Расшифровка анализа - иммуноблот

Помогите пожалуйста расшифровать анализ
ENV(GP160)+
ENV(GP110/120)+
ENV(GP41)+
GAG(P55)+
GAG(P40)+
GAG(P25)+
POL(P68)+
POL(P52)+
POL(P34)+

Здравствуйте! 2,5 года назад сдавал анализ на ВИЧ, был вот такой имунноблот:
Gp-160+, Gp-110/120+, Gp-41+, р17+, р25+, р31+, р34+, р52+, р55+, р68+. А вот имунноблот от 30.05.18 г.: Gp-160+, Gp-41+, GAG 1 -, poll+, env2-. Непонятно что значит роll+? Он что там только один или не раскрылся? И куда делись остальные белки?

Pol и Env – гены, которые кодируют группы белков. Считайте, что просто запись иная. Вопрос в другом. А что ждем то? Зачем блот рассматриваем? Все довольно ясно. Делать что-то нужно.

Уже свыкся с тем, что у меня ВИЧ. И готов к терапии.
Просто интересно послушать ваше мнение. Это, получается, свежее инфицирование или я чего-то не понимаю? Или иногда так бывает, что иммуноблот медленно очень раскрывается?

Сегодня посмотрел свои анализы в личном деле (делались в СЦ):
ИФА на первой тест-системе — положит
ИФА на второй тест-системе — отрицательный (это как это?)

Далее ИБ (делались в инвитро и СЦ месяц назад):
иммуноблот на первой тест-системе: gp 160+, gp 41+
иммуноблот на другой тест-системе: gp41+, p24+, p17+
иммуноблот на третьей тест-системе: gp160+, gp120+, gp41+, p24+

По моим прогнозам, я мог инфицироваться год назад (острая стадия была в апреле где-то), либо 9 месяцев назад, но а вообще — хз когда) Всегда предохранялся и секс без презервативов был всего лишь один раз осенью 2017.

Сегодня еще раз сдал на ВН и ИС. Теру начну через месяц, как придет заказ.

Даты поставьте к тестам упомянутым.

Первый блот раньше ИФА? Не бьется. Тут нет какого-то момента, который бы позволил сказать, что сильно вероятно свежее инфицирование, или обратное.
Останется загадкой, если не найдете случайно источник и не сопоставите.

Если уточнить, то

Сдавал в Инвитро.
Первый ИФА — 11 мая.
Потом та же сыворотка пошла на блот и пришел положительный анализ, где выявили два белка.
gp 160+, gp 41+

Далее уже сдавал в СЦ повторно.
Кровь сдавал 29 мая.
И там его прогоняли по нескольким тест-системам, где первый показал отрицательный, второй положительный. Отрицательный ИФА — это забавно все же.
Далее та же сыворотка идет на блот, откуда пришли данные:

Первая тест-система: gp41+, p24+, p17+
Вторя тест-система: gp160+, gp120+, gp41+, p24+

Но не суть.
Пришел новый анализ ИС — 754. Это радует. ВН пока не готово. Как придет, наверно, начну уже теру.

То, что инфицирование было год назад — я уверен на 80%. А то, что блот медленно раскрывается и ИФА отрицательное — это вот странно. Или это в пределах нормы?

Отрицательный ИФА — это забавно все же. Знать бы название системы еще, чтобы записать в черный блокнотик. Хотя, вот этот момент, если не брать теорию с браком, сильно за раннее инфицирование.
То, что инфицирование было год назад — я уверен на 80%. Бедноват блот для того срока. Не невозможно, но маловероятно.

В какой-то момент я даже начал сомневаться в результатах анализов на ВИЧ — поэтому жду ВН.
Тут уже поставится последняя точка в вопросе.

То, что ИС за месяц вырос на 200 копий без теры — это тоже в пределах нормы считается? Я принимаю урсосан сейчас от полипа в желчном — во вкладыше написано, что препарат повышает иммунитет.

Оценивать нужно и с относительным содержанием, и учитывать данные одной лаборатории при одном методе подсчета. Потому – бог знает, что там с CD4.

В общем, CD4 — 780 клетки/мкл. ВН — 250 копий/мл.
Это без терапии. То есть CD4 из 486 за месяц скакнул до 780.
ВН упал с 550 до 250 копий.

Все же это не странно или такие скачки в пределах нормы? Теру пора начинать?)

Здравствуйте! Сдал ифа три раза, каждый раз +, из СЦ пришел иммуноблот p24+ p18+. Потенциальный риск был более полугода назад. p24 указывает на то что это всё таки вич?

Блот сомнительный, повторить через 6-8 недель. Скорее всего ложная тревога.

Доброго времени суток!
Пришли результаты анализов, в том числе блот:

Опасный контакт: 24.04.2018
Анализ на ВИЧ ИФА 23.05.2018 (4 недели от опасного контакта или 29 дней) результат «+»
Анализ на ВИЧ ИФА 28.05.2018 (5 недель от опасного контакта или 34 дня) результат «пересдать»
Анализ на ВИЧ ИФА 01.06.2018 (5 недель от опасного контакта или 38 дней) результат «+»

Пришел блот от первого анализа (23.05.18):
GP160 сл.
P24 сл.

Сданы новые анализы 06.06.2018 ИФА и ПЦР РНК ВИЧ в местном СПИД центре. Результаты пока ждем.

Вопросы по блоту:
1. Если присутствует P24 это обязательно антиген ВИЧ или такой белок может выявляться при других заболеваниях?
2. Что означает рядом с белком сокращение «сл»? Обычно в описанных блотах есть + или –
3. От чего зависит развертываемость блота? От срока или от индивидуальных особенностей организма?
4. При таком блоте на 4-ой неделе от опасного контакта есть шанс, что это не вич?

Хорошего дня и благодарю Вас.

1. нет, это может быть просто похожий белок иной природы. 2. слабый. т.е. сомнительно. 3. сроки и реализуют индивидуальные особенность, но в среднем очень близко все. 4. вопрос неправильный, шанс есть всегда, пока не установлен диагноз.

Здравствуйте!
Помогите, пожалуйста, сориентироваться по результатам анализов и понять, как правильно себя вести, чтобы повторные анализы были корректными.

Анализы сдавала 25.05.2018
ИБ ВИЧ
NEW LAV BLOT 1 — неопред. от 29.05.2018
ИБ ВИЧ маркеры
gp 160 +
gp 120 —
gp 41 —
p55 +
p40 —
p 24 +
p18 —
p 68 —
p 52 —
p 34 —
ИФА ВИЧ
ADVIA Centaur HIV Ag-Ab Реактивность ИФА 12.00 полож. (28.05.2018)
Рекомендовано анализ повторить через 2 недели.

В ноябре 2017 был НПА, после которого сдавала анализы на тест-системе HIV Ag\Ab Combo Abbott Architect, тогда результат был отрицательный.

Параллельно сдавала общий анализ крови. Незначительно повышены лимфоциты, эозинофилы ровно 0 (но у меня такие показатели по эозинофилам были и ранее.

Основной вопрос такой:
какие лекарства можно и нельзя принимать в эти две недели? (хочется, чтобы ничего не «фонило»)
У меня периодически проходят приступы аллергии, обычно я пью тавегил. Следует ли от него отказаться?
Можно ли принимать перед анализом антибиотики? (если их назначит врач для лечения других инфекций и заболеваний)

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) — сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» — как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам — структурным белкам оболочки (env) — gp160, gp120, gp41; ядра (gag) — p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) — p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env — gp140, gp105, gp36; gag — p16, p25, p56; pol — p68.

Вопрос: Повторный анализ на ВИЧ?

Проходил обследование на инфекции полученные половым путём(никаких симптомов-хотелось уверенности в отношениях с женщиной). Тест на ВИЧ оказался положительным. Следом УЗИ показало опухоль на почке, удалили (оказалась злокачественной).
Прочитал книгу Сазоновой И.М., там написано что злокачественная опухоль может дать положительный результат анализов на ВИЧ.
Может ли быть именно так, или надеяться не на что?

Вам необходимо провести контрольный анализ на ВИЧ. Если первый тест на ВИЧ был определен методом ИФА, тогда результат может быть ложноположительным. Его достоверность можно проверить более чувствительным методом диагностики — ПЦР (полимеразная цепная реакция), который определяет ДНК вируса в крови.

помогите. 16.12.10г ИФА (+) ИБ(+) потом с 23.03.11 по 19.05.11 девять отрицательных ИФА(-) и ПЦР количествен. не определятся. в 2002 году во время беременности ИФА то (+) то (-) но ИБ всегда (-). с 2004 по 2008г сдавала по 2 раза в году ИФА(-).но 30.04.08г ифа(+) а ИБ-неопределенный. потом опять каждые 2 месяца сдавала ИФА всегда(-). а с декабря 2010 года выше написано.при этом я никогда не кололась,у мужа всегда ИФА (-). сд4 980 клеток. да и ещё кровь на сифилис от 29.04 дала 3+++.а потом три раза. отрицат.через каждые 10 дней. гепатиты все (-). было ли у кого-то подобное. спасибо.

Уточните пожалуйста, проводилась ли Вам РИБТ (реакция иммобилизации бледной трепонемы), если да, то каковы результаты этого исследования.

нет,мне никто не предложил сделать такой анализ.а что он покажет? я надеюсь вы поняли,что речь я вела об анализах на ВИЧ. спасибо. в вашей практике были подобные случаи? да кстати про ИБ в 2008 был неопределенный т.к. был белок р24/25. в 2010 ИБ(+) белки gp160.41.120 p24.17.31. потом когда ифа опять был 3раза (-) отправили на ИБ 4 апреля. результат пришёл положительный,но белки gp 120 и 41.остальные зачеркнуты красной пастой и внизу красным ИБ ПОВТОРИТЬ. но ПЦР от этого же числа отрицат. после 4 апреля я сдавала ИФА уже 4 раза отрицат. все в спид центре в том числе на антиген и антитело. сейчас жду повторный ИБ и качественнай ПЦР. вот такие дела. ОЧЕНЬ УСТАЛА ДУМАТЬ И ЖДАТЬ. НАДЕЮСЬ на ЛУЧШЕЕ. СПАСИБО. жду ответа ОЧЕНЬ.

Если Вы задаете какой либо вопрос, постарайтесь пожалуйста в следующий раз, сформулировать его более конкретно, с уточнением диагноза. РИБТ используется для подтверждения диагноза сифилис. Для точной диагностики ВИЧ инфекции, проводят определение антител к ВИЧ в крови методом ИФА и методом иммуноблот. Диагноз подтверждается только в том случае, если оба эти результата окажутся положительными.

извините что неточно сформулировала вопрос. я же написала,что в декабре ИФА и Имуноблот на вич пришли положительные. но с марта месяца ифа на вич отрицательный 9 раз. если меня в спид центре поставили на учет,то разве такое в принципе бывает. вич либо всегда положит либо отрицательный. и как при отрицат результате ИФА на ВИЧ может быть положит имуноблот? тогда все отрицат ифа нужно проверять на имуноблот,так что ли получается? в нашем спид-центре ничего мне ответить не могут. вот я и обратилась к вам. спасибо.

К сожалению, как ИФА, так и иммуноблот могут давать ложноположительные результаты. Именно поэтому, диагноз ВИЧ считается окончательным, только при одновременном выявлении ВИЧ с помощью ИФА и методом иммуноблот.

здравствуйте.сегодня получила результаты пцр на ВИЧ качественный-вирус не обнаружен и повторный иммуноблот на ВИЧ результат неопределённый из-за белка 41. в СПИД-ЦЕНтРЕ сказали,что вероятнее всего вич нет,а в моём организме есть тела похожие по строению на вич. а как вы думаете,если учитывать мои вопросы от 15 и 16 июня(см.выше) вич есть или нет. СПАСИБО.

В данном случае диагноз ВИЧ инфекции сомнителен.

вы пишите что только при одновременном выявлении вич с помощью ифа и иммуноблота диагноз вич считается окончательным. а как же тогда в моем случае быть? ведь все пцр отрицат. а блот и ифа всё время скачут. на протяжении 9 лет. подскажите,если бы вирус был в моей крови,то его рнк и днк за столько лет точно можно было определить. и может ли период инкубации или » окна» длиться столько лет? бывают ли ложноотрицат результаты пцр на вич учитывая такой промежуток времени? да я забыла сказать,что экспресс тесты на вич, сдаваемые мною в квд всегда отрицательны.или на них тоже нельзя положиться? спасибо.

В данном случае ПЦР диагностика не является основным методом выявления динамики процесса — более информативны серологические методы. В данном случае высока вероятность ложноотрицательных результатов. экспресс тесты на ВИЧ обладают высоким порогом чувствительности, потому так же могут давать ложноотрицательный результат.

простите. я точно написала не там. ответьте пожалуйста в теме ВИЧ или не ВИЧ. спасибо.

В том случае, если на Вашу почту не пришло уведомление о получении ответа, Вы можете просмотреть ответ на заданный Вами вопрос по этому адресу http://tiensmed.ru/news/answers/vich-ili-ne-vich-.html

Здравствуйте! Подскажите пожалуйста, что бы встать на учет в ЖК (сейчас 10 недель беременности) сдала анализы на вич, пару дней назад вызвал к себе доктор и сказал, что предварительные анализы на вич положительный (первый сделали в Кировограде, а официального результата с Киева еще нету), в этот же день сделали в нашей городской лаборатории два экспрес-теста фирмы «Фармаско» CITO TEST HIV 1/2, оба результата отрицательны, лаборант сказал, что эти тесты надежны и я могу не переживать, так как при беременности такое случается, а те анализы могли просто перепутать. Врач сказал снова сдать кровь и я еще дважды сдала свою кровь на анализ в разных больницах (ни одного из трех результатов до сих пор нету). Очень переживаю, я не наркоманка, сомнительных половых связей не было, если и болею то очень редко, другие анализы все в норме. Можно ли доверять экспресс-тестам? Действительно ли при беременности такое случается? Уж больно сильно врач напугал меня. Спасибо

Вам необходимо прежде всего успокоиться и не думать о плохом. Иногда при беременности, бывают ложноположительные результаты. Необходимо повторно пересдать кровь на ВИЧ и дождаться результатов обследования.

здравствуйте! дело в том что у меня 2 месяца назад произошел половой контакт с девушкой(до сих пор встречаемся). через 1,5 недели поднялась температура 37,4. вскоре спала. для уверенности мы сдали анализ ифа через 2 недели и повторно через 1,5 месяца. ответы у обоих отрицательные. но температура и кашель у меня держаться до сих пор с переменным улучшением. подскажите, пожалуйста, возможен ли риск? к тому же я длительное время работал без выходных и неделю назад был на больничном (орви). анализ крови и легких в порядке. спасибо.

Данная температура может быть связанна с перенесенным вирусным заболеванием, организм не восстановился еще, либо хроническим переутомлением. В том случае, если органическая патология исключена, общий анализ крови и мочи в пределах нормы, а так же данные флюорографического исследования так же в пределах нормы, то необходимо исключить заболевания передающиеся половым путем: хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, которые могут вызывать воспаление органов малого таза и уретры и как следствие повышение температуры тела. Подробнее о причинах повышения температуры тела читайте перейдя по ссылке: Высокая температура.

Здравствуйте. Тут такое дело- Более года назад был незащищенный половой контакт с гулящей девушкой. Она уверяла, что ничем не больна, но на все 100 процентов верить ей я не могу. Еще она уверяла, что проходила медкомиссию перед устройством на работу (она продавцом работала) и всё было нормально. Через 7 месяцев после контакта я все таки сдал анализ на вич в лаборатории ситилаб- результат оказался отрицательным. Но в последнее время я часто стал болеть- вот уже 3 неделю, как у меня красное воспаленное горло и я не могу его вылечить. Опять стал бояться, а вдруг все таки подхватил тогда? Скажите, ыозможно ли это, и стоит ли доверять анализу из ситилаб? Еще раз сдавать боюсь, нервы не выдержат..

В том случае, если результат отрицательный, то вероятнее всего вы не больны и не инфицированы ВИЧ/СПИДом. Однако для уточнения диагноза рекомендуется сдать повторно анализ в специализированных лабораториях при государственных учреждениях, данное обследование проводиться анонимно. В том случае, если самостоятельно лечение не приносит желаемого результата рекомендуется проконсультироваться с врачом отоларингологом, для проведения адекватного обследования и назначения соответствующего лечения. Подробнее об обследовании на ВИЧ читайте в цикле статей перейдя по ссылке: ВИЧ.

Скажите, а вы можете дать какую либо характеристику ситилаб лаборатории? Всё таки не всегда получается сдать анализ при государственном учреждении. И какова вероятность в процентах для мужчины заразиться при незащищенном контакте?

К сожалению, мы не даем сравнительную оценку лабораториям и частным медицинским учреждениям. В том случае, если вы сомневаетесь в достоверности результатов, проведите обследование в другом центре и предварительно попросите лицензию о предоставлении данных медицинских услуг, имеет ли данный центр право на проведение данного обследования и соответствует ли все, принятым нормативам. Риск заражение одинаков для обоих полов при незащищенном половом акте. Подробнее об обследовании на ВИЧ читайте в цикле статей перейдя по ссылке: ВИЧ.

Добрый день! Ребенку 8 месяцев, сдавали анализ на вич методом ИФА в крови обнаружено gp160 + и p25 + остальное все минус, заключение ИБ-сомнительный. Если судить по этим анализам получается что ребенок +? gp160 + gp110/120 — p68 — p55 — p52 — gp41 — p34 — p25 + p18 —

К сожалению, на основании полученных данных, поставить диагноз со 100 процентной вероятностью нельзя, так как не исключен и ложноположительный результат. Для постановки точного диагноза потребуется пройти еще ряд обследований, в том числе повторить данный анализ методом ИФА, а также сдать анализ по методике ПЦР. После этого Вам следует обратиться в специализированное лечебное учреждение, где врач инфекционист сможет в комплексе оценить полученные результаты. Подробнее узнать о проявлениях ВИЧ инфекции Вы можете в тематическом разделе нашего сайта, перейдя по ссылке: ВИЧ

Может ли показать ложноположительный результат при «ОРЗ» или более остро протекающих инфекционных заболеваний? Где-то я читал что при 58 заболеваниях или даже выше может показать «+» в том числе прививка от гепатита Б, если страдают почки И.Т.Д.?

Вероятность ложноположительного результата есть, поэтому рекомендую Вам поступить следующим образом: сделать повторно анализ — методом ИФА и методом ПЦР, после чего повторно посетить врача инфекциониста. Подробнее узнать о диагностике ВИЧ инфекции Вы можете узнать из тематического раздела: ВИЧ

Добрый день! Иммуноблот неопределенный из за белка р25. Какова вероятность ВИЧ?

В данной ситуации необходимо тщательное изучение протоколов исследования в комплексе с прочими показателями, так как на основании этих данных сделать предположение не представляется возможным. Предположительно результат можно считать сомнительным и требуется повторное исследование через 3 месяца. Подробнее читайте в разделе нашего сайта: ВИЧ

Добрый день.
Можете прокомментировать ИФА на ВИЧ
1 сыворотка +3,559 к=13,3
+2,121 к=4,9
р 24 отр
2 сыворотка +3,696 к=13,9
+2,477 к=5,7

В данном случае не исключен ложноположительный результат, учитывая, что метод ИФА является косвенным, поэтому рекомендую Вам сдать анализ по другой, более чувствительной методике — иммунный блотинг. Узнать более подробную информацию по данному вопросу Вы можете в соответствующем разделе нашего сайта, перейдя по следующей ссылке: ВИЧ

Добрый день, подскажите на что настраиваться? Год назад с мужем при планировании ребенка прошли все анализы в том числе на ВИЧ (отнеслись очень серьезно и правильно), я проходила обследование в Кр.Рогу муж в Киеве у него отрицательный ответ мне сообщили что не сработал какой то реактив необходимо повторный сдать в Центре Спида в Киеве. Сдав анализ в Центре ответ пришел отрицательный по мне тоже. Сейчас я в положении на 14 неделе т.е. встаю на учет прохожу все анализы и опять пришел ответ анализ на вич неопределенный, повторно сдала в поликлинике и прошла в » Довире» экспресс тест для успокоения,но не успокоили экспресс тест показал положительный результат (вторая полоска была менее выражена), сразу после всей этой процедуры я не теряя времени обратилась в Центр Спида сдала также анализ, ожидаю результат. (не могу успокоится) Прошу Вас подскажите насколько можно доверять экспресс анализам и почему с первого раза нет ответа на анализ вич? (мы с мужем ведем здоровый образ жизни и любим друг друга). Спасибо.

Не стоит паниковать раньше времени — экспресс диагностика не является основанием для постановки диагноза ВИЧ, она позволяет выявлять группы пациентов, которым требуется более углубленное исследование. В таких ситуациях рекомендуется провести иммунный блотинг и лично проконсультироваться с врачом инфекционистом. Узнать более подробную информацию по данному вопросу Вы можете в тематическом разделе нашего сайта, перейдя по следующей ссылке: ВИЧ. Дополнительную информацию также Вы можете получить в следующем разделе нашего сайта: Лабораторная диагностика

Здравствуйте,лежал в инфекционке, только сегодня выписали при уходе врач позвала меня и объяснила что у меня положительный ифа,сперва когда я поступил в больницу,он был отрицательный, потом когда пересдавал он стал положительным,они отправили исследования на имуноблот на сокольники гору сказали будет готов на след неделе,лежал в больнице с ангиной и вирусов парагриппа, прибываю в шоковом состоянии,до сих пор не пойму как это расценивать, выписку для моей поликлинике тоже составили с указанием что ифа обнаружено и ниже что имуноблот в работе, если завтра выписываться в свою поликлинику то в этой выписке все будет обозначено, насколько вероятность ВИЧ присутствует?может ли быть что из за того что я лечился от ангины вируса парагриппа показать положительные результаты на ифа?

Вероятность ложноположительного результата очень велика. Наличие одного положительного результата еще не дает оснований для постановки диагноза ВИЧ, поэтому рекомендуем Вам дождаться результата иммуноблотинга, после чего лично проконсультироваться с врачом инфекционистом по вопросу дальнейшего обследования и наблюдения. Ангина, парагрипп и прочие простудные заболевания существенного влияния на результаты анализа не оказывают.

хочется в это верить,но в конце августа у меня случилось недомогание,поднялась температура, 37.5-38 был жидкий стул около 4 дней,это было на отдыхе где было много дискотек,я пил воду из под крана как вообщем то и многие другие,потому что было очень дорого стакан воды стоил 300р,я связывал жидкий стул с такой температурой с какой нибудь кишечной инфекцией подхваченной в воде,не припомнить точно но была и небольшая сыпь в верхней части туловища,прилетев домой с температурой вызвал врача,она написала ротавирусная инфекция,после 5 дней больгичного я вызвался уйти с него и выйти на работу где слег через несколько дней с синуситом,(в тот промежуток времени по долгу работы мне нужно было находиться на улице)я связал это что большой перепад температуры с отпуска и отравление погнизило мой иммунитет и поэтому простудился в очередной раз с синуситом,итого это опять больничный,по указанию лора пропил клацид ср 500 в течении 10дней,прошло,вышел опять на работу через 3 недели был в командировке в жаркой стране на 3 дня. кондиционеры в транспорте и отеле были беспощадны и по возвращению домой,в самолете у меня была температура уже 39.5.тут я дома с температурой 40,вызвал врача на дом написала орви и сказала горло оч красное,у меня хронич тонзиллит и сказала это к лору,сама написала пить антибиотик Леволет р.вызывал скорую потому что лихорадило и темп была 40 и не снижалась,госпитализацию не предлагали,на след день такая же история-скорая сделала жаропонижающий укол и уехала.на третий раз я настоял на госпитализации,еле еле меня увезли в инфекционную больницу,где выявили микст инфекцию парагриппа и аденовирусную инфекцию,но при выписки врач -зав отделения сообщила что у меня выявлен вич ифа положительный и то что они его сделали два раза,я в шоке,не знаю что делать не могу есть и пить.она сказала что у меня явно выраженная острая вич инфекция и для проверки они выслали анализ моей крови на имунноблот в спид центр,
сейчас проводя аналогию событий что со мной происходило за послед время,а так же 3 больничных листа к ряду,все симптомы на себя примерил и я в ужасе от того что может быть,после выписки в этот же день я отправился сдать анализ в инвитро ананимно и на след день результат по ифа был так же +
прощу прощение за столь подробную информацию но я в сметении и убит,пью сильные успокоительные и у меня нет аппетита и я не ем практически,сильно похудел
у меня еще такой вопрос что врач с выпиской из больницы указала результат вич по ифа обнаружен и ниже что имунноблот в работе,но как я закрою бл в своей поликлинике по месту ж,там будет все написано. как мне быть?это уже не будет конфиденциальным. я попросил леч врача не писать в выписке этот анализ на что она мне отказала,на сколько тут соблюдаются мои права о нераспр информации.

К сожалению, результаты проведенных в стационаре исследований вписываются в выписку, поскольку лечащий участковый врач должен располагать информацией о Вашем состоянии здоровья в полном объеме. В данной ситуации речь не идет о разглашении информации, поскольку она лишь передается другому лечащему врачу, который далее будет Вас наблюдать.

Здравствуйте! Сдавал анализы на Вич так как нужен был сертификат для фмс,анализы не отдавали пару недель потом пригласили к заведующей и выдали с положительм результатом взяли кучу расписок и отправили в областной центр спида на дообследование так написано на справке. хочу сдать в другой клинике а потом уже идти в областной или пересдавать нет смысла? просто непонимаю почему они так долго их неотдавали ну врач сказал что якобы они делали какойто анализ и я им еще 4т рублей какбы должен ведь еслиб его делали то наверное кроме сертификата далибы детальную информацию о болезни?

В данной ситуации не следует паниковать раньше времени — получение одного положительного результата еще не позволяет судить достоверно о возможном инфицировании, поскольку не исключены ложноположительные результаты. Рекомендуем Вам сдать анализ повторно и при наличии положительного результата необходимо будет пройти еще одно обследование — иммуноблотинг. Как правило, в лаборатории подробной информации о результатах не дают, что является нормальной и обычной практикой. На все возникающие вопросы Вам может ответить лечащий врач после проведения осмотра на личной консультации.

забыл добавить что с начала июня вплоть до середины сентября я делал себе курс анаболический стероидов,а именно сустанон250-это смесь тестостеронов и станозолол с примаболаном, хотел подготовить себя к лету и отпуску,могли ли они сбить мой иммунитет и все что со мной произошло.

Нарушение иммунитета, а также наличие аутоиммунных заболеваний могут давать ложноположительные результаты анализа на ВИЧ. Именно поэтому в случае получения 2-х положительных результатов методом ИФА рекомендуется проведение иммуноблотинга, что позволит с точностью ответить на вопрос, есть инфицирование или нет.

что значит наличие аутоимунных заболеваний?какие они бывают?
вообще могу сказать что я довольно часто болел с раннего детства и даже пару тройку лет тому назад просил лечащего врача заняться моим иммунитетом,потому что была постоянная усталость и часто болел,в основном ухо горло нос,но все время были отрицательные результаты на вич,я их сдавал с достаточной легкостью,не задумываясь.

Ложноположительный результат анализа на ВИЧ может быть после недавно перенесенной вирусной инфекции, вакцинации против гепатита В, при туберкулезе, гепатите, герпесе, а также на фоне аутоиммунных заболеваний, таких как: ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, склеродермия, заболевания соединительной ткани и т.д.

К моему вопросу хочу дополнить,пришел мой иммуноблот он отрицательный,но врач сказала что так как два ифа были + когда я лежал в инфекционной больнице,то все равно нужно пересдать анализ, но чуть позже

В данном случае врачебная тактика оправдана — рекомендуем через 1,5-2 месяца сдать иммуноблот повторно.

Какова вероятность: 2 ифа + разница между заборами крови около 2дней,иммуноблот — ; лежал в инфекционной больнице с аденовирусной инфекцией и парагриппом,где и был забор крови,иммуноблот отправляли в спид центр

Добрый день! Я встала на учет в Жк, прошла все анализы врач говорит что у меня в крови герпес, потом звонят со спид центра и говорят что мне надо перездать заново, здала и мне говорят что у меня вич положительный, я в панике пошли с мужем здавать повторный анализ сдали и у меня ифа и иммуноблот + у мужа — ,здала опять через месяц. У меня + у мужа — сейчас я на 23 неделе беременности!

В данной ситуации, к сожалению, есть вероятность инфицирования ВИЧ, но окончательный диагноз ставить даже при положительном иммуноблоте нельзя, учитывая состояние беременности. В данной ситуации требуется исключение ложноположительных результатов, поэтому рекомендуем сдать анализ повторно и лично проконсультироваться с врачом инфекционистом.

если иммуноблот показал положительный результат на вич, а скрининг отрицательный какому результату верить?

Иммуноблот является более точным исследованием, поэтому при данном исследовании если получен положительный результат, требуется продолжить исследование и лично посетить врача инфекциониста.

Иммуноблоттинг – (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).

Радиоиммунный анализ (РИА)

В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Реакции иммунитета

Работа студента на практическом занятии

Работу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже).

1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках.

2. Реакция связывания комплемента

а) разобрать РСК по таблице;

б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы;

в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия);

г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК;

д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке.

3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите – что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется.

5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию – результат реакции.

6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции.

7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию – результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

Иммуноблоттинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.

Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.

Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).

В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.

Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.

Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.

По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».

Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.

Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.

Иммуноблоттинг

Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.

Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.

В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.

Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.

Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

Иммуноблоттинг - дополнительный непрямой метод

Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.

Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ - р24, gp41 и gp 120 (рис.37).

РИСУНКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.

2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.

вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М. : Гэотар Медиа, 2010. .

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.

Дополнительная литература

1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.

Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.

2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.

Главная » Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.

Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация

Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.

Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.

Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Цель

Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.

В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.

Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)

Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.

Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.

Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.

Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.

Особенности

Анализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.

Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента. Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к

Что это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?

Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция. Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.

Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы: быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.

Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.

За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.

Где сделать анализ?

Где я могу пройти тестирование на ВИЧ?

ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?

Как провести ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.

После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.

Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.

В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость

Сколько анализ? Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.

В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Интерпретация результатов

Наиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.

Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.

Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.

Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».

Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.

Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.

Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.

Что такое вестерн-блоттинг?

Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.

В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.

Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.

После проведения ДСН - электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.

51. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха-низм, компоненты, применение.

Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.

После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.

1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).

Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.

Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.

Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.

Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.

Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.

Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.

Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.

Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А - с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б - первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.

Протокол:

I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).

Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.

После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.

Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.

II. Электроперенос

Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.

Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.

III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко).

После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител.

Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном.

По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.

После тщательной отмывки (минимум 5 - 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6.

Инкубацию проводят при перемешивании 5 - 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.

Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!